ПЦР- Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) —метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо амплификации(выделения и множенье) ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, выделения новых генов.

Проведение ПЦР

Достаточно сложный и дорогостоящий метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20–40 тысяч пар нуклеотидов.

Применение ПЦР

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.

Криминалистика.

ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью электрофореза ДНК. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (англ. genetic fingerprint).

Медицинская диагностика

ПЦР для диагностики ряда инфекций является «золотым стандартом».

Достоинства метода ПЦР:

  • Среди методов диагностики инфекционных возбудителей, ПЦР обладает наиболее высокими показателями чувствительности (за счет экспоненциального накопления фрагментов ДНК) и специфичности (за счет выявления уникальных для микро-(макро)-организмов участков генетического материала). Аналитическая чувствительность АмплиСенс ПЦР-тест-систем для большинства вирусов и бактерий — 1000 микроорганизмов в 1 мл биологического материала. Специфичность ПЦР при использовании технологии АмплиСенс для всех вирусных инфекций, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%.
  • Возможность использования разнообразного клинического материала.
  • Возможность одновременного выявления нескольких микроорганизмов в одной биологической пробе, в отличие от бактериологических методов, где для разных возбудителей используются разные способы культивирования.
  • Простые требования к условиям хранения и транспортировки материала от пациента в лабораторию. Повышена стабильность при транспортировке до лаборатории, поскольку нет необходимости сохранять возбудителя в живом виде, в отличие от бактериологических и вирусологических методов.
  • Скорость проведения анализа: время получения результатов, для некоторых инфекций меньше, чем 24 часа.

Для некоторых микроорганизмов (например, Mycoplasma genitalium) ПЦР — единственный метод диагностики.

Но, несмотря на все достоинства ПЦР, преимущественное его использование для выявления инфекционного возбудителя применимо не ко всем микроорганизмам. Так, например, для таких возбудителей как стафилококк или стрептококк лучше использовать микробиологический метод, а для диагностики бруцеллеза, бореллиоза, токсоплазмоза, краснухи, кори — целесообразнее использовать иммунологические методы (например, ИФА).

ПЦР в диагностике инфекций передающихся половым путем (ИППП)

Бактерии

  • Возбудитель сифилиса (Treponema pallidum)
  • Возбудитель гонореи (Neisseria gоnorrhoeae)
  • Хламидия (Chlamydia trachomatis)
  • Микоплазмы (Mycoplasma genitallium, Mycoplasma hominis)
  • Уреаплазма (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum)

Вирусы

  • ВИЧ (HIV)
  • Генитальный герпес (HSV2)
  • Папилломавирус (HPV)

Простейшие

  • Трихомонада (Trichomonas vaginalis)

Грибы

  • Возбудитель кандидоза (Candida spp.)

Большинство вышеперечисленных инфекций протекают со схожей симптоматикой, могут приобретать затяжное, хроническое течение, что приводит к развитию осложнений (воспалительные заболевания органов малого таза, нарушение репродуктивной функции, осложнения в процессе беременности и др.). Исходя из вышесказанного, совершенно очевидно, насколько важно своевременное выявление этих возбудителей.

Метод ПЦР в диагностике ИППП позволяет:

Определить этиологию инфекции (т. е. какой именно микроорганизм или их сочетание вызвали воспалительный процесс). Для некоторых возбудителей, например, Mycoplasma genitallium, ПЦР — это единственный метод диагностики на сегодняшний день. В зависимости от ответа на данный вопрос вырабатывается тактика лечения.

Определить количество возбудителя. Особенно это актуально для условно-патогенных микроорганизмов (Gardnerella vaginalis и др.), которые вызывают патологию только при определенных условиях (например, при повышении концентрации).

Осуществить контроль за течением инфекционного процесса и оценить эффективность лечения. Однако необходимо учитывать тот факт, что ПЦР может улавливать даже единичные фрагменты ДНК, которые могут оставаться некоторое время после лечения, в связи с чем, контроль эффективности проводимой терапии рекомендуется проводить не ранее чем через 2-3 недели после ее окончания.

Благодаря своей высокой чувствительности, ПЦР позволяет выявлять возбудителя даже при минимальном его содержании. Особенно это актуально при бессимптомном течении инфекционного процесса, вызванного безусловно-патогенными микроорганизмами (гонорея, трихомоноз, хламидийная инфекция). Например, при хронической гонорее у женщин даже с помощью бактериологического метода часто не удается выявить гонококк, несмотря на имеющиеся симптомы хронического воспалительного процесса в шейке матки или уретре.

ПЦР в диагностике гепатитов

Все вирусы, поражающие печень, относятся к различным семействам, имеют разные биологические свойства и соответственно, тактика лечения будет тоже значительно отличаться в зависимости от этиологии гепатита. В связи с этим, актуальной проблемой является адекватная этиологическая диагностика вирусных гепатитов, которая невозможна без использования современных молекулярно-биологических методов, одним из которых является ПЦР.

Достоинство ПЦР в диагностике гепатитов:

1.Вирусный гепатит В (ВГВ):

а) Качественное обнаружение ДНК ВГВ:

  • Ранняя диагностика острого гепатита В — ДНК вируса гепатита В начинает обнаруживаться в крови больного гепатитом В в среднем на 20 дней раньше, чем HBsAg («Австралийский» антиген).
  • Выявление мутантных штаммов вируса гепатита В.
  • Выявление скрытых форм вирусного гепатита В.

б) Количественная оценка уровня ДНК HBV:

  • Диагностика хронического гепатита В (вирусная нагрузка более 100000 является признаком хронического гепатита В).
  • Мониторинг активности вирусной репликации у носителей HBsAg.
  • Контроль эффективности противовирусной терапии.

2. Вирусный гепатит С (ВГС): редко протекает с ярко выраженными клиническими симптомами, чаще всего это случайные находки во время лабораторного обследования (обнаружение anti-HCV IgG). Учитывая всю серьезность этого заболевания (частую хронизацию процесса (85%) и возможность развития цирроза печени), становится понятным, насколько важна лабораторная диагностика в решении этого вопроса.

ПЦР в диагностике гепатита С позволяет:

  • Установить факт инфицированности гепатитом С. Это важно при обследовании контактных лиц, т. к. РНК ВГС появляется в крови больного гепатитом С гораздо раньше чем антитела, которые появляются как минимум через 2-3 месяца с момента инфицирования (период серологического окна). Кроме того, определение anti-HCV IgG методом ИФА в некоторых случаях (часто у беременных) дает «ложноположительные» результаты, поэтому обнаружении антител к вирусу гепатита С, рекомендуется подтверждать качественным обнаружением РНК, и в зависимости от результатов ПЦР определяется тактика ведения пациента.
  • Установить наличие показаний к противовирусному лечению, а также выбрать оптимальную схему лечения. Решить эти вопросы помогают количественное определение уровня РНК ВГС (при низкой вирусной нагрузке эффективность лечения выше) и определение генотипа ВГС (генотип 1 хуже отвечает на противовирусную терапию по сравнению с генотипами 2 и 3).
  • Своевременно оценить эффективность проводимого лечения. Так, наиболее эффективными препаратами для лечения хронического гепатита С на сегодняшний день остаются препараты интерферона в комбинации с рибавирином. Курс лечения гепатита С (генотип 1) составляет 48 недель, но уже на 12 неделе лечения врач может оценить эффективность проводимой терапии, сопоставляя результаты анализов до начала лечения и на 12 неделе лечения.
  • Оценить устойчивость ответа на лечение. Для этого проводят обнаружение РНК ВГС после окончания лечения, через 24 недели и через 72 недели после окончания лечения.

ПЦР в диагностике ВИЧ-инфекции

В настоящее время ПЦР на ДНК провируса ВИЧ используется как диагностическая методика для прямой диагностики ВИЧ-инфекции в следующих случаях:

  • В период серологического «окна». Чувствительность ПЦР на провирусную ДНК ВИЧ колеблется от 96 до 99%, в связи с чем, несмотря на высокие показатели чувствительности, ПЦР следует проводить или совместно с ИФА или с последующим подтверждением ИФА;
  • В случае сомнительного результата методом иммуноблоттинга;
  • При обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей. Использование ПЦР в этом случае позволяет сократить сроки постановки диагноза ВИЧ-инфекции с 18 месяцев до 3-6 месяцев. ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний ВИЧ, Герпес, ВПЧ и др.). Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.

Установления отцовства

В настоящее время для установления отцовства используется генетический анализ, или ПЦР-анализ (полимеразная цепная реакция). Точность этого анализа чрезвычайно высока

— когда результат анализа ребенка и обоих родителей положительный, то есть установление отцовства состоялось, вероятность ошибки не превышает 0,01%, или одна ошибка на десять тысяч случаев анализа ДНК. В том случае, если результат установления отцовства — отрицательный, ошибки быть не может, результат достоверен абсолютно.

Клонирование генов

Клонирование генов (не путать с клонированием организмов) — это процесс выделения генов и, в результате генноинженерных манипуляций, получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор — фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена — РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве.

В медицине используются препараты полученные так называемым рекомбинантным способом, когда в геном некоторых бактерий вживляется ген, отвечающий за продукцию определенных веществ. И в результате этого, лабораторная генмодифицированная колония микроорганизмов начинает производить точную копию кодированного вещества в промышленных масштабах. Таким способом, например получают высоко очищенный и высоко типичный — человеческий инсулин, который входит в большинство современных препаратов инсулина для лечения сахарного диабета. В репродуктологии таким препаратом является Пурегон — рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и др.

Мутагенез

В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза — управляемая мутация (внесения изменений в нуклеотидную последовательность ДНК). Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.

Поделиться

Внимание!

День открытых дверей

Если Вы живете в другом городе

Согласуйте день приезда с врачом заранее, чтобы визит прошел с максимальной пользой для Вас, и вы смогли в день приезда узнать об ЭКО в Санкт-Петербурге как можно больше информации и получили полноценную консультацию от наших специалистов. Наши администраторы, при необходимости, могут помочь с размещением в Санкт-Петербурге, предложив Вам на выбор уютные номера в частной гостинице в нашем здании или в комфортной, полностью благоустроенной, квартире бизнес-класса в шаговой доступности от метро.